Desarrollo y optimización de técnicas de extracción y análisis de compuestos con actividad biológica en maqui (Aristotelia chilensis)

La baya maqui (Aristotelia chilensis) es una fruta de color púrpura/negro de unos 6 mm de diámetro, originaria de América del Sur. El maqui, también conocida como “superfruta”, es una rica fuente de compuestos de interés biológico, mostrando uno de los niveles más altos de compuestos fenólicos totales y antocianinas de todas las frutas. Debido a su composición, presenta un gran potencial antioxidante y propiedades antiinflamatorias y anticarcinógenas, lo que contribuye a proporcionar muchos beneficios para la salud. En los últimos años, la demanda de esta fruta se ha incrementado gracias a su interés comercial y científico. Debido a que se han comercializado recientemente, es necesario desarrollar técnicas para su extracción y análisis. En este trabajo, se han desarrollado dos métodos de extracción diferentes, la extracción asistida por microondas (MAE) y la extracción asistida por ultrasonidos (UAE), comparando las ventajas e inconvenientes de cada uno de ellos para la extracción tanto de los compuestos fenólicos totales como de las antocianinas. Para ello, se realizó un diseño de experimentos de tipo Box-Behnken, empleando cuatro variables en el caso de MAE (porcentaje de metanol en el disolvente, pH, temperatura y relación “masa de muestra/volumen de disolvente”) y 6 en el caso de UAE (porcentaje de metanol en el disolvente, pH, temperatura, relación “masa de muestra/volumen de disolvente, amplitud y ciclo) y dos respuestas (concentración de compuestos fenólicos y antocianinas totales). Para la cuantificación de los compuestos fenólicos totales, se ha empleado el procedimiento de Folin-Ciocalteu, el cual permite obtener la concentración total de estas moléculas mediante espectroscopía UV-Vis. Para la identificación de las antocianinas se ha empleado un equipo de cromatografía de ultra-eficacia acoplado a un espectrómetro de masas, y para su separación y cuantificación, se ha utilizado un equipo de cromatografía HPLC con detector UV-Vis, midiendo a 520 nm, siendo ésta la longitud de onda del máximo de absorción de las antocianinas. Se ha obtenido que, independientemente de la técnica de extracción empleada, para conseguir extraer los compuestos fenólicos totales presentes en el maqui, el parámetro más influyente es la temperatura; mientras que para conseguir extraer las antocianinas presentes en el maqui, el principal parámetro es el porcentaje de metanol. Posteriormente, se llevaron a cabo ensayos de cinética para obtener el tiempo óptimo de extracción de estos compuestos de alto interés biológico. Además, se efectuaron ensayos de repetibilidad y precisión intermedia, obteniendo un resultado positivo en todos los casos, con un coeficiente de variación inferior al 5%. Estos resultados indicaron que ambas técnicas empleadas son robustas y precisas. Finalmente, los dos nuevos métodos se aplicaron con éxito a muestras reales para investigar la presencia de compuestos fenólicos totales y antocianinas en varios alimentos elaborados con bayas maqui.El trabajo de Fin de Grado tiene 60 páginas

Aplicación de herramientas metabolómicas para el estudio del carácter pungente en pimientos

En las últimas décadas, el vínculo entre nutrición y salud ha ganado aceptación universal y, por tanto, se ha dado una importancia creciente a los regímenes dietéticos basados en vegetales ricos en antioxidantes. El pimiento es uno de los cultivos de hortalizas de mayor valor a nivel mundial debido a sus propiedades organolépticas, su riqueza en compuestos bioactivos y su fuerte capacidad antioxidante. Su consumo ha aumentado mucho, pero actualmente la sociedad no solo demanda una mayor producción del cultivo tradicional sino versiones mejoradas que contengan compuestos beneficiosos para la salud. El consumo de pimientos picantes se asocia generalmente con sensaciones picantes, ardientes o punzantes. La pungencia de estos frutos se debe a dos grupos de compuestos químicos conocidos como capsaicinoides y capsinoides. Estos compuestos han exhibido una gran cantidad de propiedades biológicas de relevancia farmacológica, como antioxidantes, antiinflamatorios, analgésicos, antimicrobianos, anticancerígenos o tratamientos antiobesidad. Sin embargo, los capsinoides se caracterizan por tener un nivel de picor significativamente inferior, lo que hace que su uso en aplicaciones culinarias, concentrados e industria farmacéutica tenga una mayor aplicabilidad ya que no se vería limitado por las características pungentes. El análisis en detalle de estos compuestos se ha visto a menudo desfavorecido tanto por problemas inherentes a los cultivos, como por la ausencia de metodologías asequibles y con el suficiente grado de optimización. Por este motivo, es necesario desarrollar y optimizar técnicas de separación y extracción, que permitan estudiar la composición química de distintas variedades de pimiento e indiquen aquellas que son ricas en los compuestos de interés para obtener extractos de mayor calidad. De esta manera, dichos métodos serían de gran valor para los laboratorios analíticos, así como para empresas o industrias, ya que permiten evaluar la calidad de diferentes variedades y conseguir una mejor selección del producto final gracias a su cuantificación analítica. En relación a la separación y cuantificación de compuestos bioactivos, las técnicas más utilizadas con diferencia son las de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y más recientemente la cromatografía líquida de ultra-alta eficacia (UHPLC). En cuanto al proceso de extracción de los compuestos químicos de la matriz vegetal, se ha producido recientemente una creciente demanda de técnicas que acorten los tiempos de análisis, reduzcan el consumo de disolventes orgánicos y tengan una mayor eficiencia y rendimiento. Las técnicas verdes nacen para responder a los retos del siglo XXI de proteger tanto al medio ambiente como a los consumidores. Entre estas técnicas se encuentra la extracción asistida por ultrasonidos (UAE) y la extracción asistida por microondas (MAE). El interés en el estudio de la acumulación de compuestos antioxidantes durante la maduración de la planta está aumentando porque su contenido se considera un parámetro importante con respecto a la calidad de las frutas y verduras. Los pimientos se consumen y cosechan en diferentes etapas de maduración, desde verde inmaduro hasta completamente maduro. A lo largo de la maduración, se producen numerosos cambios bioquímicos, fisiológicos y estructurales. Estas variaciones no solo tienen implicaciones agronómicas bien conocidas (sabor, color, aroma, tamaño), sino que también son relevantes para determinar su uso y calidad. En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el desarrollo y validación de un método UHPLC, que permita la separación y determinación simultánea de los cinco capsaicinoides mayoritarios (n-DHC, C, DHC, h-C, h-DHC) y los dos capsinoides principales (CTO y DHCTO) en pimientos. Se ha conseguido la separación de todos los compuestos de interés con buena resolución en un tiempo inferior a 2 minutos. A continuación, se ha optimizado la extracción de los compuestos de interés del pimiento mediante ultrasonidos y microondas. Para evaluar el efecto de las variables independientes sobre la eficacia de extracción, se ha utilizado un diseño estadístico de mezcla y un diseño de experimentos de Box Behnken (BBD) con el fin de determinar las condiciones óptimas, que fueron 5 minutos de tiempo de extracción a una temperatura de 5,5 ºC, pH 8 y empleando un ratio de 0,2:14,5 g:mL para UAE; y 5 minutos de tiempo de extracción a una temperatura de 60 ºC, pH 8 y un ratio de 0,2:15 g:mL para MAE. Los métodos han demostrado ser precisos, reproducibles, económicos y rápidos para obtener altas recuperaciones de los compuestos de interés. Finalmente, se han estudiado los cambios en la concentración de capsaicinoides y capsinoides a lo largo de la maduración en distintas variedades de pimiento. Se pretende determinar cuál es el momento óptimo de recolección, y si la tendencia es la misma en capsaicinoides y capsinoides, así como en distintas variedades sembradas bajo las mismas condiciones de cultivo, riego, temperatura, humedad y fertilización. - A diferencia de lo reportado en la bibliografía, en la variedad Naga Jolokia, la máxima concentración de capsaicinoides se alcanza el día 33 de maduración y luego cae drásticamente con una reducción superior al 96%. En el caso del capsiato, alcanza su máxima cantidad el día 19, seguido de una disminución gradual hasta el final de la maduración. - En el caso de las variedades Habanero, Habanero Roxo y Malagueta, la acumulación de capsiato se incrementa hasta el día 27 de maduración, donde alcanza el mayor valor y luego disminuye drásticamente hasta el final del proceso. Para Bode, el capsiato aumenta desde el inicio hasta el final de la maduración el día 76. Al compararlo con la evolución de capsaicinoides, ya realizado previamente en el grupo de investigación, se puede observar que, en Habanero y Bode, ambas familias de compuestos siguen la misma tendencia; mientras que en Habanero Roxo y Malagueta no. - Al centrarnos en la variedad ornamental Filius, se ha demostrado la posibilidad de comer frutos de pimiento con similares sensaciones picantes y diferente color y/o forma; así como frutos con el mismo color pero que presentan distinto grado de pungencia

Desarrollo de nuevas metodologías analíticas para la determinación de compuestos de interés biológico en pimientos

Los pimientos son frutos pertenecientes a la familia Solanaceae y al género Capsicum. Se suelen utilizar como especies que añaden sabor y aroma a los alimentos, por lo que tienen una gran importancia comercial. Su principal característica es la acritud, causada por unos compuestos químicos conocidos como capsaicinoides. Los capsinoides son compuestos muy similares a los anteriores, con la única diferencia del enlace central, es decir, los capsaicinoides son amidas mientras que los capsinoides son ésteres. Ambos compuestos presentan las mismas actividades biológicas y efectos beneficiosos para la salud, como antioxidantes, anticancerígenos, antitumorales y analgésicos; además provocan un aumento de la energía del cuerpo y una disminución de la acumulación de grasa y de colesterol. Sin embargo, los capsinoides son mucho menos irritantes, no pungentes y más apetecibles para ser ingeridos de forma habitual en la dieta. A pesar de sus grandes beneficios, son compuestos que se degradan fácilmente y a gran velocidad, por lo que es necesario desarrollar técnicas de extracción y análisis que indiquen aquellas variedades de pimientos que presentan una mayor cantidad de los mismos. En este trabajo, se ha desarrollado la extracción asistida por ultrasonidos (UAE) y por microondas (MAE) de capsinoides en pimientos Biquinho, usando métodos estadísticos multivariantes. En primer lugar, se llevó a cabo un diseño estadístico de mezcla, obteniendo como disolvente óptimo un 42% de metanol y 58% de acetato de etilo para ultrasonidos y un 100% de metanol para microondas. Una vez obtenido el disolvente óptimo, se realizó un diseño de experimentos de Box-Behnken con cuatro variables (tiempo, temperatura, pH y relación “masa de muestra/volumen de disolvente” (ratio)) y una respuesta (concentración de capsiato). Para la separación y cuantificación de capsinoides se empleó un equipo de cromatografía UHPLC-DAD. En el caso del UAE, la única variable influyente fue el ratio; mientras que para la MAE no se obtuvo ninguna variable significativa. Estos resultados hacen referencia a que se tratan de dos técnicas bastante potentes, que permiten extraer la mayor cantidad de capsiato presente en las muestras de pimientos, independientemente de la variación de cualquiera de los factores analizados. Posteriormente, se efectuaron ensayos de repetibilidad y precisión intermedia, obteniendo coeficientes de variación inferiores al 5%, lo que indicaron que ambas técnicas son robustas y precisas. Finalmente, los métodos desarrollados se aplicaron a distintas variedades de pimientos, para determinar la cantidad de capsinoides

Optimization and Comparison of Ultrasound and Microwave-Assisted Extraction of Phenolic Compounds from Cotton-Lavender (Santolina chamaecyparissus L.)

The interest in natural phenolic compounds has increased because of their attractive use especially as antioxidant and antimicrobial agents in foods. The large content in phenolic compounds of interest in Santolina chamaecyparissus L. (S. chamaecyparissus) makes this plant a target source that is worthy of note. In this work, new extraction technologies comprising ultrasound (UAE) and microwave (MAE) assisted extraction of the phenolic compounds in S. chamaecyparissus have been developed, optimized, and compared. Several extraction factors have been optimized based on a Box-Behnken design. Such optimized factors include the percentage of methanol in water (25-75%), the temperature (10-70 degrees C), the ultrasound amplitude (20-80%), the ultrasound cycle (0.2-1 s), the solvent pH (2-7) and the solvent-sample ratio (5/0.2-15/0.2 mL/g) with regard to UAE, while the percentage of methanol in water (50-100%), the temperature (50-100 degrees C), the pH (2-7) and the solvent-sample ratio (5/0.2-15/0.2 mL/g) were optimized for MAE. The solvent composition was the most influential parameter both on MAEs (64%) and UAEs (74%). The extraction optimum time was established as 15 min for MAE and 25 min for UAE. Five major phenolic compounds were detected and identified by Ultra-High-Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time of Flight-Mass Spectrometry (UHPLC-QToF-MS) in the extracts: chlorogenic acid, quercetin 3-O-galactoside, quercetin 3-O-glucoside, isoorientin, and cynarin. With the exception of chlorogenic acid, the other four compounds have been identified for the first time in S. chamaecyparissus. The findings have confirmed that MAE is a significantly more efficient extraction method than UAE to extract phenolic compounds from S. chamaecyparissus

Ultrasound-assisted extraction of betalains from opuntia fruit pulp of different color varieties

Betalains are water-soluble pigments that have exhibited important pharmacological properties such as antioxidant, anticancer, antilipidemic and antimicrobial activity. These compounds have been isolated in numerous purple plants or fruits, as is the case of the wild species under the Opuntia genus. The fruits of these species are often disregarded because of their small size as well as the frequent presence of prickles. Based on this, this research has as its objective the optimization of a method based on ultrasound-assisted extraction to obtain extracts enriched with betalains from a wild Opuntia species (Opuntia dillenii (Ker Gawl.) Haw.). Four variables (%EtOH in the solvent, temperature of extraction, ultrasound amplitude and cycle) were selected using a Box-Behnken design. The quadratic interaction of %EtOH and the interaction of %EtOH-cycle have proven to be influential variables at 95% confidence. The conditions to obtain the highest betalain concentration were 100 mg of pulp with 20 mL (60%:40% EtOH:H2O) solvent at 20 degrees C at 24% amplitude and 0.2 cycle for 10 min. The suitability and reliability of the method were evaluated with repeatability and intermediate precision tests obtaining CVs <5%. Finally, the developed method has been employed in the analysis of five Opuntia commercial samples and obtained significant antioxidant activity of the extracts, confirming its applicability.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Alternativas didácticas de la Estadística Inferencial en el pregrado de las ciencias de la salud

Se presenta una propuesta de alternativa didáctica en el proceso docente educativo del pregrado de las Ciencias de la Salud mediante la cual se articula la enseñanza por problemas -enseñanza problémica- con el aprendizaje significativo, que favorecen la comprensión y motivación por la asignatura Estadística Inferencial. Dicha materia es objeto de estudio en los primeros años del pregrado, y herramienta de trabajo en investigaciones relacionadas con Ciencias de la Salud, tanto clínicas como epidemiológicas, en general, en aquellas donde prime el uso de métodos cuantitativos para el análisis de datos y se parta del estudio de muestras probabilísticas. Hasta hoy existe la evolución de una sociedad en la que roles y desempeño de la profesión médica estaban ajustados a la mera aplicación de conocimientos adquiridos, a una sociedad científica donde la investigación pasa a formar parte esencial de su labor diaria.

Influence of Fruit Ripening on the Total and Individual Capsaicinoids and Capsiate Content in Naga Jolokia Peppers (Capsicum chinense Jacq.)

"Naga Jolokia" (Capsicum chinense Jacq.) is a hot pepper variety native to India which has received the attention of the global scientific community due to its high capsaicinoid concentration. The present study evaluated the influence of fruit ripening on the total and individual capsaicinoids, as well as capsiate content. The aim was to determine the optimal moment to harvest the peppers depending on their pungent properties. Ultrasound-assisted extraction (UAE) using methanol as the extraction solvent and reverse-phase ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC-photodiode array (PDA)) were employed. Capsaicinoids gradually accumulated in the peppers from the moment they started growing until they reached a maximum concentration (7.99 +/- 0.11 mg g(-1) of fresh weight (FW)) at 33 days postanthesis (dpa). For this reason, based on its content of pungent compounds, as it is one of the main attributes of this variety, the optimal time for collection would be on day 33. From then on, there was a sharp decrease (96.35% of the total concentration) due to the peroxidase enzymes. The evolution of the principal capsaicinoids in "Naga Jolokia" peppers had a different behavior with respect to literature reports. After this investigation, these changes in content can be attributed to each pepper genotype. Capsiate content reached it maximum value at 19 dpa (0.27 +/- 0.01 mg g(-1) of FW). Then, there was a gradual drop due to the activities of different peroxidases. Given the important biological activity of capsaicinoids and capsinoids, the information described here allows for determining the ideal time to harvest "Naga Jolokia" peppers

Prescribed burning in spring or autumn did not affect the soil fungal community in Mediterranean Pinus nigra natural forests

Producción CientíficaIn the context of global change, wildfires are not only a threat but are also increasing in their severity in forest ecosystems worldwide, affecting and modifying vegetation, wildlife, and fungal dynamics. Mediterranean ecosystems are frequently affected by fire and prescribed burning is being increasingly used as a tool to reduce the risk and severity of wildfires. Although some of the effects of prescribed burning have been studied, the best moment to perform a prescribed burn to reduce the impact of fire on fungal communities has not been fully investigated. In this study, we analysed the effect of prescribed burning in two different seasons (spring and autumn) on soil fungi associated with natural Pinus nigra forests. Four years after prescribed burning was applied, our analyses showed that the total fungal richness and the composition of fungal communities in spring-burned, autumn-burned, and unburned control plots did not differ significantly. However, analyses of specific phyla and functional trophic groups did reveal some significant differences between spring- or autumn-burned plots and unburned control plots. Valuable edible fungi, which were not affected by the prescribed burning, were also found in the study area. Thus, our results suggest that prescribed burning is not only an interesting tool that could be used to reduce the risk of wildfire but also is compatible with the conservation of fungal communities, and could even promote specific valuable edible species, generating complementary incomes for the rural population. Although further studies are needed, our analyses suggest that the season (spring or autumn) in which prescribed burning is performed does not affect fungal conservation and, therefore, does not need to be one of the factors taken into consideration when selecting the most appropriate time to perform a prescribed burning.Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (projects RTA2017-00042-C05-01 and PID2019-105188RB-I00

Optimizing and Comparing Ultrasound- and Microwave-Assisted Extraction Methods Applied to the Extraction of Antioxidant Capsinoids in Peppers

Capsinoids are very similar antioxidant compounds to capsaicinoids, but less irritating, non-pungent and more palatable, and can thus be used in greater concentrations for food applications. To date, three capsinoids (capsiate, dihydrocapsiate, and nordihydrocapsiate) have been isolated from the pepper fruits. Due to its substantial commercial importance, it would be convenient to determine which pepper varieties have a richer content. Ultrasound- (UAE) and microwave- (MAE) assisted extraction have been implemented and analyzed using multivariate statistical methods. Firstly, di erent solvents were tested individually. The three best solvents were used in a set mixture design, where 42% methanol and 58% ethyl acetate were determined as the optimum combination for UAE, and 100% methanol for MAE. Subsequently, a Box–Behnken experimental design with four variables for both UAE and MAE (time, temperature, pH and sample mass:solvent volume “ratio”) was performed. The sample mass:solvent volume was the most influential variable in UAE; while for MAE no variable was any more influential than the others. Finally, both optimized extraction methods were successfully applied to di erent varieties of peppers. Besides, to demonstrate the e ciency of both extraction methods, a recovery study was performed. The results prove the potential of both techniques as highly adequate methods for the extraction of capsinoids from peppers

Assessment of Ultrasound Assisted Extraction as an Alternative Method for the Extraction of Anthocyanins and Total Phenolic Compounds from Maqui Berries (Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz)

Research interest regarding maqui (Aristotelia chilensis) has increased over the last years due to its potential health benefits as one of the most antioxidant-rich berries. Ultrasound-assisted extraction (UAE) is an advanced green, fast, and ecological extraction technique for the production of high quality extracts from natural products, so it has been proposed in this work as an ideal alternative extraction technique for obtaining extracts of high bioactivity from maqui berries. In order to determine the optimal conditions, the extraction variables (percentage of methanol, pH, temperature, ratio “sample mass/volume of solvent”, amplitude, and cycle) were analyzed by a Box-Behnken design, in conjunction with the response surface method. The statistical analysis revealed that the temperature and the percentage of methanol were the most influential variables on the extraction of the total phenolic compounds and total anthocyanins, respectively. The optimal extraction time was determined at 15 min for total phenolic compounds, while it was only 5 min for anthocyanins. The developed methods showed a high precision level with a coefficient of variation of less than 5%. Finally, the new methods were successfully applied to several real samples. Subsequently, the results were compared to those that were obtained in previous experiments by means of microwave assisted extraction (MAE). Similar extraction yields were obtained for phenolic compounds under optimized conditions. However, UAE proved to be slightly more efficient than MAE in the extraction of anthocyanins